Polimerase Chain Reaction, yani bilinen adıyla PCR; 1985 yılında Karry Mullis (Celera Genomics) tarafından bulunan ve 1993 yılında ona Nobel Kimya Ödülü kazandıran, moleküler biyolojinin büyük bir kısmında kullanılan bir metottur. Bu metot sayesinde herhangi bir organizmanın genomik DNA’sının belirli bölgeleri yani belirli nükleotidleri in vitro ortamda (hücre dışı) çoğaltılabilir [6]. Bu çoğaltma sırasında yüksek sıcaklığa dayanıklı enzimler kullanılır. Taq polimeraz enziminin keşfi, PCR uygulamalarının artmasını sağlamıştır. Çünkü bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi çalışabilen tek enzim olma özelliğinin gösterir. Diğer yandan kullanılan DNA polimeraz enzimleri yüksek sıcaklığa dayanıklılığı, yarılanma ömrü, nükleotid ekleme hızı vb. gibi parametrelerle seçilmektedir.
Şekil 1: PCR Cihazı (Thermocycler) [3].
PCR Nerelerde Kullanılır?
PCR; İnsan Genom Projesi başta olmak üzere, babalık tayini, kalıtsal hastalıkların tespiti, DNA dizi analizi ve haritalanması, gen klonlama, genetik parmak izi tanınması, evrim sürecinin araştırılması gibi birçok moleküler biyoloji alanında kullanılmaktadır. Bunun dışında bitki tohumlarının saflığını belirlemek gibi tarımsal faaliyetlerde de kullanılmaktadır[5].
Çalışma Mekanizmasıyla PCR
Temel mekanizması, yüksek sıcaklıkta bozulmayan bir polimeraz enzimi sayesinde ısı düzenleyici de kullanarak hedef DNA bölgelerinin tekrar tekrar çoğaltılmasına dayanır [1]. Isı düzenleyicilerin amacı sıcaklığı değiştirerek polimerizasyon için gereken 3 ana basamağın gerçekleştirilmesini sağlamaktır. Bu basamaklar sırasıyla denatürasyon, bağlanma ve uzamadır. Denatürasyon aşamasında DNA’nın ikili sarmal yapısı 94-96 °C arası sıcaklıkta 15-60 saniye tutularak bozulur. İki tane tek zincirli hale gelen DNA yapısı annealing (bağlanma) aşamasında ortamda bulunan küçük nükleotid zincirlerine (primerler) bağlanır. 47°C- 60°C arasında ve yaklaşık 30-60 saniye arasında gerçekleşen bu işlem, nükleotid zincirinde bulunan guanin-sitozin çiftlerinin yoğunluğuna bağlı olarak değişebilmektedir. G-C çiftlerinin fazlalığı, bağlanmayı güçleştireceğinden sıcaklık yaklaşık 68°C’ye kadar arttırılmaktadır. Aşağıda verilen denkleme göre çoğaltılacak DNA bölgesinin nükleotid sayısına göre Tm değeri belirlenir ve bağlanma sıcaklığı bu değerin 5 fazlası olarak kullanılır.
Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T )
Bağlanma sonrası zincirlerin uzaması için gerekli olan basamak elongation (uzama) basamağıdır. Uzama işleminin gerçekleşmesi için yaklaşık 72 °C sıcaklık ve 30 saniye ile 3 dakika arasında süre gereklidir. Bu işlemle birlikte bir döngü tamamlanmış olur. İdeal bir PCR sisteminde 30- 40 döngü yapılmaktadır [1]. Diğer yandan her bir döngüde DNA miktarı teorik olarak iki katına çıkmaktadır. Oluşan ürünün miktarı ilk başta PCR sistemine koyulan DNA miktarına bağlıdır.
Şekil 2: DNA’nın PCR ile Çoğaltılması [4].
PCR sonuçları, karşılaştırmalı jel elektroforez yöntemiyle belirlenmektedir. Elektroforezde yürütülen sonuçların bant uzunluğuna göre elde edilen DNA miktarı tayin edilir.
PCR Çeşitleri
· Yuvalanmış(Nested) PCR
· Demirlenmiş(Anchored) PCR
· Geri(Revers) Transkripsiyon PCR
· Asimetrik PCR
· Ters(Inverse) PCR (IPCR)
· In Situ PCR
· Çoklu(Multipleks) PCR
· Real Time PCR [2].
KAYNAKLAR
4-https://www.drozdogan.com/polimeraz-zincir-reaksiyonu-nedir-pcr-tarihcesi-nasil-yapilir/ 01.09.2020
6- http://yunus.hacettepe.edu.tr/~coner/GEN/04/PCR.htm 01.09.2020
Comentarios